二甲亞砜在羥自由基檢測中的應用
羥自由基（•OH）是一種氧化能力很強的自由基，它可以通過電子轉移、加成以及脫氫等方式與生物體內的多種分子作用，造成糖類、氨基酸、蛋白質、核酸和脂類等物質的氧化性損傷,使細胞壞死或突變。因此，•OH參與的各種研究已成為醫學、生物學、生物化學和環境化學等領域中的重要研究課題。但由于•OH的反應活性大，壽命短，存在濃度低，給有關的研究和測定造成一定難度。目前，通常采用如下方式：電子自旋共振法（ESR）[1]、高效液相色譜法（HPLC）[2]、化學發光法[3]、熒光法[4]、分光光度法[5，6]。這些方法中大多數都采用•OH捕捉劑與其結合生成相對穩定的自由基，用新生成的自由基特性來間接測定•OH的表觀生成率。
二甲亞砜（DMSO）為無色透明液體（或結晶），是一種既溶于水又溶于有機溶劑的極為重要的非質子極性溶劑。吸濕性強，無腐蝕、無毒。性質穩定，長時間在沸點溫度下加熱，微量分解；在堿性狀態下可抑制腐蝕或分解。能參與氧化、還原、鹵化、脫羧、絡合等化學反應，并能起到加速的作用。由于其優良的性能，被廣泛應用于醫藥、農藥、石油、化工、有機合成、電子、涂料、冶金、染料和高分子材料等許多化學工業領域。
近年來，國內外均有報道，利用DMSO捕集•OH，定量測定•OH的產率。筆者結合國內外有關文獻，對DMSO在•OH檢測中的應用作介紹，從而為•OH的進一步研究提供參考。
1 采用DMSO捕集•OH的測定方法
1.1 HPLC
HPLC是一種高效、快速的分離技術，它具有高壓、高速、高效和高靈敏度的特點，只需要微升數量級的樣品就可以進行全面分析，檢測器最小檢測量可達10-9～1011 g[7]。測定過程中必須先選擇合適的化合物捕集被測體系中的•OH，使之生成具有一定穩定性，且能被液相色譜分離與檢測的產物，然后用HPLC進行測定。
近幾年，DMSO常用來作為捕捉劑，定量測定•OH 的產率。首先使DMSO與•OH反應生成甲基亞磺酸(CH3SOOH)和甲基自由基,然后用重氮鹽與甲基亞磺酸反應,生成的重氮化合物利用HPLC測定。其測定原理為：
Fe2++H2O2→Fe3++OH-+OH• （1）
CH3SOCH3+OH•→CH3SOOH+CH3• （2）
O
‖
CH3SOOH+Ar－N=N+→Ar－N=N—S—C3+H+ （3）
‖
O
用堅牢黃GC鹽與通過二甲基亞砜捕捉•OH后生成的甲基亞磺酸反應，將生成的鄰-氯苯重氮甲基砜用乙酸乙酯萃取，然后用HPLC定量地測定了Fenton反應體系中產生的•OH。以Capcell-Pak NH2為流動柱，乙醇與正己烷混合液(3∶100，體積比)為流動相分離，流速為1 mL/min；檢測器為Shimadzu SPD-10AV紫外－可見分光光度計，C-R6A積分議；檢測波長為285 nm；進樣：20 μL/次。RAO等[8]等用DMSO作捕捉劑，在甲硫氨酸或催化酶的作用下，與•OH作用生成甲基亞磺酸。使用Radical-Pak C18柱，以5%甲醇為流動相(流速2 mL/min)進行分離，在214、240 nm波長下檢測，檢測限為50 ng •OOH和200 ng •OH。GAMOH等[9]用DMSO捕獲•OH生成甲基亞磺酸，再同堅牢藍BB鹽反應生成偶氮砜。在40 ℃，STR-ODSⅡ柱，80%乙腈作流動相分離，420 nm檢測，線性范圍達到0.01 mol/L。比較了幾種重氮鹽與甲基亞磺酸的反應產物通過HPLC的測定結果（見表1）。相比較而言，堅牢黃GC鹽與甲基亞磺酸反應產物的信號不但出現尖銳的單峰，且峰高不受Fe2+等離子的影響[10]。
表1 幾種重氮鹽與甲基亞磺酸的反應產物通過HPLC的測定結果
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1.2 熒光法
某些物質的分子能吸收能量而發射出熒光，根據熒光的光譜和熒光強度，對物質進行定性或定量的方法，稱為熒光分析法。該法具有靈敏度高，選擇性強，需樣量少和方法簡便等優點。它的測定下限通常比光度法低2～4個數量級，應用非常廣泛。近年來，DMSO作為•OH的探針試劑引起了人們的關注。楊小峰等[11]使•OH先與DMSO反應, 定量生成甲基自由基, 然后甲基自由基被自旋標記熒光探針I捕捉, 形成強熒光產物, 熒光強度的增量（ΔF）與反應生成的甲基自由基的量成正比，也與參加反應的•OH的量成正比。基于上述原理建立的表征•OH的實驗方法，具有操作簡單、專一性好、靈敏度較高和易于推廣等特點，可用于化學與生物體系中•OH 的表征。谷學新等[12]采用Fenton體系產生•OH與DMSO反應產生甲醛，然后與乙酰丙酮、氨發生Hantzsch反應生成的3，5-二乙酰-1，4-二氫吡啶，其最大激發波長和發射波長分別為419.4、505.5 nm，通過測定熒光強度的變化可以間接定量羥基自由基的產生量。TAI等[13]利用DMSO和•OH反應生成定量的甲醛這一反應，再用氨和1，3-環己二烯聚酯在pH為4.5的條件下和甲醛反應，產生熒光吸收在400.4、452.3 nm的物質，通過測定熒光的大小，即可判斷羥基自由基的量。
1.3 比色法
比色法作為一種定量分析的方法，最早開始于19世紀30～40年代，是以生成有色化合物的顯色反應為基礎，通過比較或測量有色物質溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。該法簡便實用，費用低廉，操作簡單，易為一般實驗室所用。宋艷等[14]采用Fenton體系產生•OH與DMSO反應產生甲醛，再與2，4-二硝基苯肼(DNPH)反應生成穩定的酒紅色腙類物質(HCHO-DNPH)，其最大吸收波長為390 nm，光度法測定其含量可間接測定•OH的生成量。徐向榮等[15]利用Fenton反應產生的•OH與DMSO反應，生成甲基亞磺酸，再與堅牢藍BB鹽反應生成偶氮砜，比色法測定其含量可間接測定OH•的生成量。
1.4 其他方法
DMSO常被用作•OH的捕獲劑，其優點是它對大部分的生物體系具有較高的容忍度以及對•OH有較好的靈敏度。TAKESHITA等[19]用DMSO來捕獲大鼠體內通過X-射線產生的•OH，生成甲基自由基，再以PBN（苯基叔丁基氮氧化合物）捕獲甲基自由基，通過電子順磁共振（EPR）間接檢測•OH的含量，該結果為研究人類受輻射傷害的程度提供了一定的參考。楊青等[17]報道了Fenton反應產生的輕自由基氧化DMSO，生成的甲醛與乙酞乙酸乙酷和氨發生Hantzsch反應，反應產物3，5-二乙氧基碳基-2，6一二甲基-1，4一二氫吡啶在－1.09 V(SCE)處有一靈敏的二階導數極譜峰，通過峰電流變化可間接測定•OH。VULCANO等[18]研究表明，DMSO在捕捉生理產生的•OH時，對TNF-a的抑制作用相對較小，具有較好的捕捉效果。還可以將•OH與二甲基亞砜反應產生甲烷，應用氣相色譜儀檢測所生成的甲烷，判斷該反應體系有無•OH生成以及測定•OH的相對含量。但是，氣相色譜法測定•OH存在專一性問題，而且靈敏度和重復性較差。
2 結語
隨著人們對環境問題的重視，高級氧化技術以其高效、快速、無二次污染等眾多優點而成為環境污染治理的一個重要方法，而羥基自由基的定量、在線、準確檢測是研究高級氧化反應機制的重要手段與工具。DMSO由于其優良的特性，常被用來作為•OH的捕捉劑，定量測定•OH產率。相信隨著該研究領域的進一步深入，DMSO在•OH檢測中的應用會越來越廣泛。
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